Molecular Detection of Cytotoxin Associated Gene A and E of Helicobacter pylori Isolated from Patients Undergoing Upper GI Endoscopy in Khartoum State

Abstract

Abstract Background: Helicobacter pylori cytotoxin associated gene pathogenicity island (cag-PAI) is one of the strain-specific genes (they do not exist in all strains). It is a deoxyribonucleic acid (DNA) fragment contains 31 genes, including; cagA, cagE, virB11 genes, in addition to other genes that code for functional components of a type IV secretion system. These genes are involved in inducing inflammation, ulceration, and carcinogenesis. This study aimed to detect and characterize cagA and cagE virulence genes of H. pylori strains from Sudanese patients with gastric discomfort in Khartoum State. Methods: This was a descriptive cross-sectional study conducted during the period from 2018 to 2020. A total of 288 gastric biopsies were collected endoscopically by the gastroenterologist in different Khartoum hospitals, using 1.0 ml brain heart infusion broth with 15% glycerol as transport media. Gastric biopsies were homogenized and plated on H. pylori selective media and incubated in standard microbiological conditions. DNA was extracted from the biopsies using the guanidine chloride extraction method and stored at -70˚C until use. The polymerase chain reaction was used for the detection of H. Pylori (using specific primers targeting 16S rRNA and glmM genes) and two virulence factor encoding genes (cagA and cagE genes). Five cagA and 21 cagE amplified gene products were sequenced and the sequences were analyzed and compared with reference sequences (JF798705.1& MK074991.1 for cagA, AB191082.1, and AY153111.1 for cagE). Data were analyzed using the Statistical Package for Social Science (SPSS version 11.5) computer program. Frequencies were calculated. The Chi-square test was used. Results: Out of 288 specimens, 98 (34%) were positive for H. pylori (glmM and/or 16S rRNA positive). Fifty-one percent of the H. pylori-positive patients were females and 49% were males. The majority of the H. pylori-positive patients were adults 97% and 3% were adolescents. There was no statistically significant association between the presence of H. pylori, epidemiological findings (geographical distribution of patients (P-value= 0.257), gender (P-value= 0.076) and age groups (P-value= 0.784)) and endoscopic findings (P-value= 0.440). The isolation of H. pylori by culture was failed and no bacterial growth in all 288 specimens. The cagA gene was present in 40/98 (41%) specimens, their clinical diagnosis as followed: the majority of them 29 (72.5%) from patients with gastritis, 6 (15%) duodenal ulcer, 2 (5%) esophagitis, and 3 (7.5%) were diagnosed as normal by endoscopy. The cagE gene was present in 38/98 (39%) specimens, their clinical diagnosis as followed: 28 (73.7%) from patients with gastritis, 1 (2.6%) gastric ulcer, 4 (10.5%) duodenal ulcer, 2 (5.3%) esophagitis and 3 (7.9%) were diagnosed as normal. Thirteen specimens (13%) were positive for cagA only, 11/98 (1%) were positive for cagE only, 27/98 (28%) were positive for both genes, 51/98 (52%) were positive for one gene at least, 47/98 (48%) were negative for both genes. There was no statistically significant association between the presence of these virulence genes and the clinical diagnosis (P-value= 0.305). The alignment of 5 cagA and 21 cagE protein sequences with JF798705.1 and AY153111.1 reference sequence respectively revealed a substitution of one amino acid in two cagA protein sequences, these two sequences have proline (P) instead of alanine (A), with 100% identity to MK074991.1 reference sequence. In addition to that one cagE protein sequence revealed a substitution of one amino acid; this sequence has valine (V) instead of isoleucine (I), with 100% identity to AB191082.1 reference sequence. Conclusion: H. pylori low prevalence in this study (34%) indicates that Sudan is in the low-risk region for infection. There is high dissemination of cagA and cagE genes in H. pylori from Sudanese patients. Still, they have reduced virulence. The cagA and cagE protein sequences have synonymous amino acid variations. المستخلص الخلفية: جينات جرثومة المعدة المصاحبة للجينات المسببة للأمراض الجينية (cag-PAI) هي واحدة من الجينات الخاصة بالسلالة (لا توجد في جميع السلالات). إنها جزء من حمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) تحتوي على 31 جينًا، بما في ذلك؛ جينات cagA و cagE و virB11 بالإضافة إلى الجينات الأخرى التي ترمز للمكونات الوظيفية لنظام الإفراز من النوع الرابع. تشارك هذه الجينات في إحداث الالتهاب والتقرح والسرطان. الهدف من هذه الدراسة هو الكشف عن جينات الضراوة cagA و cagE لسلالات جرثومة المعدة من المرضى السودانيين الذين يعانون من اضطرابات في المعدة في ولاية الخرطوم. الطرائق: كانت هذه دراسة وصفية مقطعية أجريت خلال الفترة من 2018 إلى 2020.تم جمع 288 خزعة معدة بمنظار المعدة من قبل أخصائي أمراض الجهاز الهضمي في مستشفيات مختلفة في الخرطوم، باستخدام 1.0 مل brain heart infusion broth مع 15٪ جلسرين كوسيط نقل. تم تجانس خزعات المعدة. وتزريعها على وسائط انتقائية لجرثومة المعدة و حضنت في ظروف مايكروبيولوجية قياسية .تم استخراج الحمض النووي من الخزعات باستخدام طريقة استخراج كلوريد الغوانيدين و تخزينها في -70 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل للكشف عن جرثومة المعدة (باستخدام بادئات محددة تستهدف جينات 16S rRNA و glmM) واثنين من جينات ترميز عامل الضراوة (جينات cagA و cagE). تم تسلسل 5 منتجات جينية مضخمة cagA و 21 cagEو تم تحليل التسلسلات و مقارنتها مع التسلسلات المرجعية (JF798705.1 و MK074991.1 لـ cagA و AB191082.1 و AY153111.1 لـ cagE). .تم تحليل البيانات باستخدام البرنامج الحاسوبي للحزمة الإحصائية للمعلومات الاجتماعية (SPSS الإصدار 11.5). تم حساب الترددات. تم استخدام اختبار .Chi-Square النتائج: من أصل 288 عينة، كانت 98 (34٪) موجبة لجرثومة المعدة (glmM و/ أو 16S rRNA). كان واحد وخمسون بالمائة من المرضى المصابين بجرثومة المعدة من الإناث و 49٪ من الذكور. غالبية المرضى المصابين بجرثومة المعدة كانوا بالغين 97٪ ، و 3٪ كانوا مراهقين. لم تكن هناك علاقة ذات دلالة إحصائية بين وجود جرثومة المعدة و النتائج الوبائية (التوزيع الجغرافي للمرضي (قيمة = P 0.257)، الجنس ( قيمة= P 0.076) والفئات العمرية (قيمة = P 0.784)) و النتائج بالمنظار (قيمة = P 0.440) .فشل عزل جرثومة المعدة عن طريق التزريع ولم يكن هناك نمو للبكتريا في جميع العينات البالغ عددها 288. كان الجين cagA موجودًا في 40/98 (41٪) عينة، تشخيصهم السريري على النحو التالي: غالبيتهم 29 (72.5٪) من مرضى التهاب المعدة، 6 (15٪) قرحة الاثني عشر، 2 (5٪) التهاب المريء، و 3 ( 7.5٪) كانت طبيعية وقد تم التشخيص عن طريق منظار المعدة. كان جين cagE موجودًا في 38/98 (39٪) عينة، تشخيصهم السريري على النحو التالي:: 28 (73.7٪) من مرضى التهاب معدي، 1 (2.6٪) قرحة معدية ، 4 (10.5٪) قرحة الاثني عشر، 2 ( 5.3٪) التهاب المريء و 3 (7.9٪) كانت طبيعية. كانت ثلاث عشرة عينة (13٪) موجبة لـ cagA فقط ، 11/98 (1٪) كانت موجبة لـ cagE فقط ، 27/98 (28٪) كانت إيجابية لكلا الجينين ، 51/98 (52٪) كانت موجبة لجين واحد على الأقل،47/98 (48٪) كانت سلبية لكلا الجينين. لم تكن هناك علاقة ذات دلالة إحصائية بين وجود جينات الضراوة و التشخيص السريري (قيمة = P 0.305). كشفت محاذاة 5 تسلسلات cagA و 21 cagE مع التسلسلات المرجعيةJF798705.1 و AY153111.1 على التوالي عن استبدال حمض اميني واحد في تسلسل بروتينين cagA ، يحتوي هذان التسلسلان على البرولين (P) بدلاًمن الألانين (A) ، مع تطابق 100٪ لـلتسلسل المرجعي MK074991.1 ، بالاضافة الى ان تسلسل بروتين cagE كشف عن استبدال حمض اميني واحد ، هذا التسلسل يحتوي على فالين (V) بدلاً من (isoleucine (I ، مع تطابق 100 ٪ للتسلسل AB191082.1. الخلاصة: إنخفاض انتشار جرثومة المعدة في هذه الدراسة (34٪) يشير إلى أن السودان في منطقة منخفضة الخطورة للعدوى. هناك انتشار كبير لجينات cagA و cagE في جرثومة المعدة من المرضى السودانيين، ومع ذالك لديها ضراوة منخفضة. تسلسلات بروتين cagA و cagE لهما اختلافات مترادفة في الأحماض الأمينية.